Conteudo adicional Laboratório 5
Conteúdo de apoio para melhor entendimento dos experimentos que serão realizador no laboratório 5 do X curso de verão de Bioquímica e Biologia Molecular do departamento de Bioquímica do IQ-USP.
Como calcular atividade enzimática-aspectos práticos e teóricos
Como calcular uma atividade enzimática? Quebra de uma ligação b-glicosídica, liberando um composto amarelo (para-nitrofenil). A enzima quebra a ligação entre o substrato e essa substância colorida, e a intensidade da cor pode ser medida em aparelho adequado. (Espectofotômetro ou leitor de placas). Quebra de uma ligação b-glicosídea, liberando um composto amarelo (para-nitrofenil). Quanto maior a absorbância medida, maior foi a atividade da enzima, em um certo intervalo de tempo. Representação esquemática de uma placa de 96 poços, com a adição do conjunto "enzima + substrato". Colocar a placa em banho maria (normalmente 30°C, depende da enzima). Parar a reação com carbonato de sódio pH11 em 4 tempos diferentes (5;10;15;20 minutos, por exemplo). Esquema de placas para ensaio de atividade enzimática. Nesse esquema está representado a leitura de 3 amostras (a1;a2;a3), em 4 tempos diferentes (t1;t2;t3;t4). Representação de uma placa de 96 poços e um leitor de placas. Tabela com resultado da leitura de uma placa em que foi realizado este experimento. Ênfase nos 4 tempos da amostra 1. Após a obtenção da leitura, plotar um gráfico simples entre a absorção em cada poço, em relação ao tempo de incubação. Gráfico da amostra 1. Tempo X Absorção. Para medir uma atividade enzimática de fato, é preciso transformar estes valores de absorção, em quantidade de produto formado. Para isso é necessário a construção de uma CURVA PADRÃO DE PARA-NITROFENOLATO. Construção de uma curva padrão Construção de uma curva padrão de para-nitrofenolato. Utilizar a equação de reta obtida (nesse caso, y=0.0355x+0.0829) para transformar os valores de absorção obtidos no experimentos por valores de nmol de p-nitrofenolato. Utilização da equação da reta para transformação de absorbância em nmol de para-nitrofenolato formado. Substituir os valores de absorção encontrados no "y" da equação da reta encontrada. Reta Absorção X Tempo Note que a primeira reta que havia sido obtida, relaciona o tempo de incubação, com a absorbância de cada leitura.Uma das estratégias para se medir a atividade de uma enzima, é a utilização de substratos ligados a substâncias coloridas.
Como calcular inativação térmica através da cinética enzimática
Cinética de Inativação Térmica Técnica utilizada para determinar a termoestabilidade de uma certa amostra de enzima. Nos tempos marcados nos tubos (em minutos), transferir uma alíquota de 250ul da amostra que está em banho maria para o tubo correspondente (QUE DEVE ESTAR SEMPRE NO GELO!) Agora, medir a atividade enzimática dos 12 tubos em 30 ºC, como mostrado no slideshow ?MEDIDA DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA?
