Metodologia

1. Extração e Quantificação de proteínas

1.1. Protocolo de extração de proteínas totais

- Coletar células a 3.000 g, 5 min, 37ºC;

- Ressuspender pellet de células em tampão de lise composto por 20 mM HEPES pH 7.9, 20% glicerol, 200 mM KCl, 0.5 mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.5 mM DTT, 1% coquetel de inibidor de protease;

- Sonicar as células ressuspendidas 3 vezes no nível 3, com tempos de pulso de 10s, separados por 1 minuto de intervalo;

- Centrifugar lisado a 15.000 g, por 10 min, a 4ºC. Retirar o sobrenadante (extrato total de proteínas).

1.2. Protocolo de quantificação de proteínas totais pelo método de Bradford.

O ensaio de Bradford será realizado em placa de ELISA de 96 poços, consistindo num volume final de 200 ul para cada poço da placa.

- Prepara solução estoque de BSA 10 mg/ml. Diluir 10 vezes a solução para efetuar as diluições para preparar a curva de calibração.

- Preparar curva padrão com as seguintes concentrações de BSA: 0,125 ug/ml; 0,25 ug/ml; 0,5 ug/ml; 0,75 ug/ml; e 1,0 ug/ml. Diluir BSA em tampão de extração de proteínas. Aplicar 5ul de amostra de proteína na placa.

- Após aplicar as amostras de proteína na placa, em triplicata, adicionar 195 ul de reagente Bradford. Lembrar-se de aplicar o branco, no caso o tampão de extração de proteínas (seguir mesma mistura que as proteínas: 5 ul de tampão + 195 ul de reagente Bradford).

- Incubar as amostras, sob leve agitação, por 5 minutos.

- Efetuar leitura da absorbância no comprimento de onda de 595 nm em espectrofotômetro.

- Construir curva de padronização, com as concentrações de BSA na abscissa e as absorbâncias médias na ordenada. Plotar no Excel, obtendo equação de ajuste linear.

- Medir a absorbância da amostra do extrato total de proteína (média das triplicatas) e estimar o valor da concentração de proteínas na amostra (variável ?x?) substituindo o valor da absorbância na equação linear resultante da curva padrão (variável ?y?)

2. GEL SDS-PAGE

2.1. Preparo dos géis

 

- Vortexar o tubo contendo o gel, e depositar a solução até 5,5 cm.

- Após depositar o gel de migração, adicionar isopropanol utilizando pipeta até completar altura de aproximadamente 0,5 cm acima da marcação.

- Deixar polimerizar por aproximadamente 15 minutos

- Eliminar o isopropanol lavando com água destilada e secar com papel Watmann.

- Adicionar TEMED/PSA no gel de empilhamento e por em cima do gel de migração.

- Colocar o pente referente ao tamanho do espaçador e polimerizar por 15 minutos.

- Retirar o pente e transferir as placas para o suporte branco com a face da placa menor voltada para o interior do suporte. Marcar a base dos pocinhos com caneta.

- Introduzir o cassete montado dentro do rack e em seguida fechar as abas.

- Lavar os pocinhos com tampão de corrida (tampão de corrida 1X e SDS 1%).

2.2. Preparo das Amostras

- Pré-aquecer o Sample Buffer 5x em banho-maria 37˚C

- Tomar uma alíquota de 475 μl de tampão e adicionar 25 μl de 2-Mercaptoetanol.

- Diluir o tampão com a amostra na proporção 1:4, e aquecer por 3-5 min a 95˚C

- Carregar as amostras e o marcador de peso molecular no gel.

2.3. Corrida

- Colocar o cassete na cuba e preencher com o tampão de corrida.

- Correr em 100 Volts até a amostra percorrer todo o gel de empilhamento

- Passar para 150 Volts para correr pelo gel de migração durante aproximadamente 60min (o tempo de migração é relativo podendo variar de acordo com a concentração do gel de migração e tamanho da banda de interesse).

3. Western

3.1. Montagem do ?Sandwich?

- Cortar a Membrana de Nitrocelulose nas dimensões do gel. Cortar 6 papéis Whatmann do mesmo tamanho (gerar a força de capilaridade).

- Umedecer a superfície da plataforma inferior do Aparelho Transferidor com o Tampão de Transferência.

- Encharcar 3 papéis Whatmann em Tampão de Transferência e acomodá-los sobre a superfície do Aparelho Transferidor.

- Hidratar a membrana em Tampão de Transferência durante 2 minutos e colocá-la sobre os papéis Whatmann. Rolar levemente uma pipeta de vidro sobre o pré-sandwich para eliminar possíveis bolhas.

- Desmontar a cuba de eletroforese e desacoplar as placas de vidro; com o auxílio de uma espátula, separar as duas placas de vidro para retirar o gel. Molhar as pontas dos dedos com o Tampão de Transferência e transferir o gel para o sandwich depositando-o sobre a membrana. Colocar os 3 papéis Whatmann umedecidos sobre o gel e eliminar as bolhas.

- Umedecer a superfície da plataforma superior do Transferidor e fechar o aparelho.

3.2. Transferência

- Aplicar uma corrente constante segundo as recomendações do equipamento usado.

- Após esse tempo, remover os papéis Whatmann sem mover o gel e verificar se a transferência funcionou erguendo o canto do gel onde foi carregado o Marcador de Peso Molecular.

- Caso as bandas do Marcador de Peso Molecular não tenham sido transferidas para a membrana, remontar o sandwich e continuar a transferência por um período maior.

- Caso tenha transferido, as bandas do Marcador serão bem visualizadas na membrana. Transferir a membrana para um recipiente contendo água destilada.

- Enxaguar o excesso de sal e adicionar a Solução Vermelha de Ponceau. Deixar agir durante 15 segundos e recuperar a solução. Enxaguar várias vezes com água destilada até que as amostras em cada canaleta sejam visualizadas.

- Enxaguar uma última vez com Tampão de Lavagem até que o Ponceau tenha desaparecido completamente.

3.3. Bloqueio

- Descartar a solução do Tampão de Lavagem e adicionar um volume de Tampão de Bloqueio suficiente para deixar o gel imerso.

- Deixar a membrana bloqueando sob leve agitação (orbital) durante 30 minutos a 1 hora. O tempo de bloqueio depende da especificidade de cada anticorpo primário. Em todos os casos, 1 hora pode ser o tempo inicial para testar anticorpos novos.

3.4. Incubação com o Anticorpo Primário

- Descartar a solução do Tampão de Bloqueio e enxaguar rapidamente a membrana com água destilada para remover o excesso de leite.

- Adicionar 10 ml da Solução do Anticorpo Primário. (200mg de BSA + 10mL de tampão de lavagem + Anticorpo). O Anticorpo primário deve ser diluído segundo as recomendações do fabricante, porém pode ser necessário padronizar esta diluição.

- Vedar o recipiente com veda-filme e incubar a membrana ?overnight? sob leve agitação orbital a 4oC. (Obs: pode incubar por um tempo menor, devendo ser ajustado conforme o anticorpo).

3.5. Incubação com o Anticorpo Secundário

- Recuperar a Solução do Anticorpo Primário e lavar a membrana com aproximadamente 30 ml de Tampão de Lavagem de acordo com os tempos: 2 X rápido, 2 X 15 min, 2 X 5 min.

- Adicionar 10mL da Solução do Anticorpo Secundário. Se esse anticorpo for de quimde Tampão de Bloqueio.

- Descartar a Solução do Anticorpo Secundário e lavar a membrana com aproximadamente 30 ml de Tampão de Lavagem de acordo com os tempos definidos abaixo: 2 X rápido, 2 X 15 min, 2 X 5 min.

- Preparar a membrana para revelação.

3.6. Revelação

- Scanear a membrana no aparelho Odyssey (Licor) no comprimento de onda que excitar o fluoróforo associado ao anticorpo secundário utilizado no experimento (700 ou 800nm).